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細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中水的質(zhì)量要求
提起細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗,每個經(jīng)歷過的實驗者都會有這樣的領(lǐng)悟吧,
細(xì)胞虐我千百遍,我待細(xì)胞如初戀。
明明小心翼翼的操作,
細(xì)胞總會莫名其妙的被污染了!
莫名其妙的掛掉啦!
到底怎么回事呢?
其實造成細(xì)胞污染的因素不單單是微生物,培養(yǎng)環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會影響細(xì)胞的生長。水是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境,營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中,才能為細(xì)胞吸收和排泄。對于體外培養(yǎng)的細(xì)胞來說,水是所有細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑中簡單、但也是重要的組分。所以,細(xì)胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高,培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì),即使含量極微,有時也會影響細(xì)胞的存活和生長,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
水中的雜質(zhì)對水質(zhì)有不同影響:
1.離子——平衡滲透壓;一些重金屬 (Cadmium)對細(xì)胞毒害大,即便劑量很低 (< 0.1 ppb);
2.微生物——污染,改變微環(huán)境如pH,影響增殖,死后釋放內(nèi)毒素等;
3.內(nèi)毒素——改變細(xì)胞外形、活化細(xì)胞、促進(jìn)或抑制細(xì)胞分裂、影響細(xì)胞附著等;
4.有機(jī)物——影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。
水質(zhì)評價常用的指標(biāo):
1. 電阻率(electrical resistivity)
衡量實驗室用水導(dǎo)電性能的指標(biāo),單位為MΩ•cm,隨著水內(nèi)無機(jī)離子的減少電阻數(shù)值逐漸變大。
2. 異體菌落數(shù)(Heterotrophic bacteria count,HBC)
衡量實驗室用水微生物的指標(biāo),單位為cfu/mL。
3. 有機(jī)物(Total Organic Carbon ,TOC)
水中碳的濃度,反映水中可氧化的有機(jī)化合物的含量,可間接反映出水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。
4. 內(nèi)毒素(Endotoxin)
革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖細(xì)胞壁碎片,又稱之為“熱原”,單位EU/mL。
參考標(biāo)準(zhǔn)化組織的實驗室純水規(guī)范ISO3696,美國CLSI和ASTM D1193的試劑純水規(guī)范,我國GBT6682和GBT 30301的試驗用水指導(dǎo),《實驗細(xì)胞資源的描述標(biāo)準(zhǔn)與管理規(guī)范》用水指導(dǎo),結(jié)合多年的實驗操作經(jīng)驗,總結(jié)出細(xì)胞培養(yǎng)用水對水質(zhì)的要求。
細(xì)胞培養(yǎng)對水質(zhì)的要求:
1.一定要無菌:HBC < 0.01 cfu/mL
2.無蛋白及核酸酶和內(nèi)毒素:無內(nèi)毒素或無熱源<0.03EU/mL
3.阻礙細(xì)胞生長的有機(jī)物含量要低:TOC <5 ppb
4.去除離子含量:電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水中純水機(jī)的配置要求
細(xì)胞培養(yǎng)過程中,各種培養(yǎng)液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過嚴(yán)格的純化處理,不含離子和其他的雜質(zhì),即使是儲存試劑的玻璃器皿,在自來水沖洗過后也應(yīng)用超純水漂洗三次以上。目前,市場上供應(yīng)的純水裝置種類較多,比如自來水進(jìn)水同時制備二級純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置,可以由自來水進(jìn)水通過預(yù)處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI(連續(xù)電流電去離子)模塊等純化后達(dá)到二級純水,儲存于水箱中以滿足日常的清洗應(yīng)用;水箱中的水再經(jīng)過U Pack超純化柱去離子,紫外燈照射殺菌并降低有機(jī)物含量,后經(jīng)終端濾器RephiBio過濾,以獲得無菌、無熱源、無核酸酶的超純水。
水路圖
要想達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)用水的水質(zhì)要求,純水機(jī)的配置非常關(guān)鍵,帶有消毒模塊的純水水箱、終端過濾器、取水水質(zhì)的實時監(jiān)測等配置都關(guān)系著產(chǎn)水水質(zhì)是否達(dá)標(biāo)。
純水的儲存對保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的,由于周圍環(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH,所以儲存水的容器要盡量密封,避免和外界過多接觸,抑制微生物生長。如Genie純水設(shè)備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器,能夠大限度的保證水箱內(nèi)的純水水質(zhì)。
水箱空氣過濾器(含CO2吸附劑) | 200/350L 水箱空氣過濾器 |
主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài) |
終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物,滿足不同實驗的應(yīng)用需求。對于細(xì)胞體外培養(yǎng)可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器,安裝在樂楓超純水系統(tǒng)的出水口,可有效去除水中的熱原(內(nèi)毒素)、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì),制備符合細(xì)胞培養(yǎng)用水要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌)。
對于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率、細(xì)菌和內(nèi)毒素的含量,必須做到即取即用,因此取水的遠(yuǎn)程監(jiān)控和水質(zhì)實時監(jiān)測就顯得尤為重要。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的實驗室純水機(jī)(如上面提到的Genie),將水機(jī)和取水手柄分別放在潔凈間的內(nèi)外,通過無線控制取水手柄達(dá)到超純水的取用和實時檢測水的電阻率和TOC數(shù)值,非常適合無菌環(huán)境下的操作,大限度減少污染。
無線 · 自由 | |
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手柄觸屏信息
? 系統(tǒng)運行狀態(tài):待機(jī),泄壓,循環(huán),產(chǎn)水 ? 水箱液位:0%或者L ? 純水(超純水)水質(zhì)參數(shù):電阻率、TOC、溫度 | |
終 端 水 質(zhì) 實 時 監(jiān) 測 |
結(jié)合上述用水要求,為大家推薦兩款制備超純水的水機(jī),Genie G一體化純水儀和Genie PURIST 超純水儀。
Genie G一體化純水儀 以自來水為進(jìn)水制備超純水和 EDI 二級純水 | 性能指標(biāo) |
Genie PURIST 超純水儀 以純水(EDI 純水,RO 水或蒸餾水等)為進(jìn)水,制備實驗室超純水。 | 性能指標(biāo) |
【注意事項】
1.超純水應(yīng)當(dāng)注意使用時間,應(yīng)該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導(dǎo)致水質(zhì)下降。
2.在合適的環(huán)境使用超純水。環(huán)境中的VOC(揮發(fā)性有機(jī)物),細(xì)菌等都會影響細(xì)胞培養(yǎng)。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的容器應(yīng)當(dāng)潔凈無污染。
4.配制離散細(xì)胞用的消化液和細(xì)胞洗滌液時,宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液,緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機(jī),避免鈣、鎂離子促使細(xì)胞凝聚作用的產(chǎn)生。
不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇指南
細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)的整個流程中實驗用水貫穿每一個環(huán)節(jié):
1.取材:組織的清洗和灌注試劑用水,如PBS緩沖液、Hanks液的配制;
2.原代培養(yǎng):1640、DMEM等培養(yǎng)基用水,明膠等支持物的配制,添加藥物、檢測試劑的配制;
3.傳代培養(yǎng):胰酶等消化液的配制;
4.凍存:細(xì)胞凍存液DMSO的配制。
細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞類型一般分為動物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng),其中難的是動物細(xì)胞的培養(yǎng)。動物細(xì)胞的培養(yǎng)除了需要無菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件,它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì),其中原代細(xì)胞的培養(yǎng)是難的。植物細(xì)胞的培養(yǎng)需要光照和激素,而且培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)比較成熟。微生物培養(yǎng)多為單細(xì)胞生物,微生物人工培養(yǎng)的條件比動植物細(xì)胞簡單得多,蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養(yǎng)基即可滿足微生物的營養(yǎng)要求,其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復(fù)雜,需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。
由于細(xì)胞的種類和培養(yǎng)條件不同,對培養(yǎng)環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同,那么配制培養(yǎng)基或試劑用水的選擇大有講究,不同細(xì)胞體外培養(yǎng)用水的指標(biāo)如下:
細(xì)胞體外培養(yǎng)用水選擇
細(xì)胞類型 | 純水等級 | 電阻率 (MΩ·cm) | TOC (ppb) | 微生物 (cfu/mL) | 內(nèi)毒素(Eu/mL) | 核酸酶 (pg/mL) |
動物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
植物細(xì)胞 | 超純水 | >18 | <10 | <1 | <0.002 | ND |
微生物 | 實驗室Ⅱ級純水 | >10 | <50 | <1 | NA | NA |
從上表可以看出,動物細(xì)胞和植物細(xì)胞的培養(yǎng)對去除內(nèi)毒素和核酸酶的要求很高,用于這兩類細(xì)胞培養(yǎng)可以選擇商品化的細(xì)胞培養(yǎng)用水,另外去除純水中的內(nèi)毒素和核酸酶可以通過在純水機(jī)的取水口安裝終端濾器達(dá)到。
各種細(xì)胞培養(yǎng)用水的比較
細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 制備方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
商品化細(xì)胞培養(yǎng)用水 | 純水或超純水進(jìn)行多效蒸餾制成,嚴(yán)格控制熱源、無菌、內(nèi)毒素、pH、滲透壓等指標(biāo) | 水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程度化高,可保證實驗結(jié)果的重復(fù)性 | 價格昂貴 |
DEPC水 | DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水,無RNase、DNAase和proteinase。 | *去除核酸酶 | 價格昂貴,未去除內(nèi)毒素 |
終端濾器過濾超純水 | 采用0.22µm的過濾膜,可有效去除水中的熱原(內(nèi)毒素)、核酸酶、細(xì)菌等雜質(zhì)。 | 性價比高,供水量大 | 對取水環(huán)境要求高 |
樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜,可制備符合生物領(lǐng)域應(yīng)用要求的超純水(無熱原、無DNase、無RNase、無菌),純水中內(nèi)毒素含量低于0.001 Eu/mL,核酸酶的含量低于可檢測范圍,微生物的含量低于0.1 cfu/mL,可以滿足動物細(xì)胞和植物細(xì)胞的需求。
Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個月,以保證使用效果。